Micro - SeqTM平衡易位携带者PGD检测
两条不同源的染色体各发生断裂后，互相变位重接而形成两条结构上重排的染色体称相互易位。这种易位大多数都保留了原有基因总数，对基因作用和个体发育一般无严重影响，故称平衡易位。平衡易位是人类中最多的一类染色体结构畸变，在新生婴儿中的发生率约为1/500～1/625。
罗氏易位是一种特殊的染色体重排类型，是指两个近端着丝粒染色体在着丝粒或其附近断裂后，短臂丢失，染色体长臂融合成为一条染色体，结果染色体数目减少，长臂数不变，但短臂数减少两条的现象。罗氏易位主要发生在5条近端着丝粒染色体（13、14、15、21和22号染色体）上。人群发生率约为1/1000。
—— 平衡易位的风险 ——
人类有23对46条染色体，染色体的数量、结构相对恒定。
由于染色体平衡易位仅有位置的改变，没有可见的染色体或基因的增减，所以，平衡易位携带者在生活中表型与普通人没有区别。然而，平衡易位的携带者与正常人婚后生育的子女中，却有可能得到一条衍生的异常染色体，继而导致某一易位节段的增多（部分三体型）或减少（部分单体型），由此引起的遗传物质减少或增加就会破坏遗传物质的平衡，最终导致胎儿畸形或自然流产。
具体来说，在平衡易位染色体分离形成配子的过程中，会形成一种叫作四射体的结构，考虑到分离规律以及交换重组的情况，这种四射体最终可能产生18种配子，这就导致最终产生的胚胎中，只有一种为完全正常，一种为表型正常的染色体平衡易位携带者，其余16种均为异常胚胎。因此，染色相互易位携带者获得完全正常胚胎的几率只有1/18。
染色体平衡易位携带者自然妊娠风险非常大,主要以早孕期自然流产为主，所以对于染色体平衡易位携带者推荐通过人类辅助生殖技术进行生育，挑选正常的胚胎植入，从而避免生育风险。
—— 检测难点 ——
目前的胚胎植入前染色体筛查多用于筛查由于易位产生的种种遗传物质不平衡的胚胎，如何进一步将易位携带者和完全正常胚胎区分开，还存在一些问题：
1)需求/伦理：携带者表型多正常，平衡易位导致在临床上正常生育的概率高于理论上的1/9，而且这种概率还会受到包含哪两条染色体、断裂点的位置及染色体易位携带者的性别等因素的影响
2)技术局限：平衡易位携带者本身未发生基因数量的缺失，一般的高通量测序和芯片技术难以区分易位型胚胎与完全正常胚胎；
3)检测难点：断点精确位置的不易确定，为后期的胚胎区分带来困难。
—— 指南与共识 ——
由于还没有一个非常成熟的技术，目前对于易位型胚胎的区分国内外各协会均并没有出台指南规范或专家共识；并且由于易位型胚胎染色体的特殊性，目前单纯依靠一种方法无法区分正常胚胎与易位型胚胎， 2010年ESHRE（European Society of Human Reproduction and Embryology，欧洲人类生殖及胚胎学会）发布的《基于荧光原位杂交的PGD最佳实践指南》中指出，单纯基于荧光原位杂交的PGD技术不足以分辨正常和携带平衡易位的胚胎，2013年ACOG（American College of Obstetricians and Gynecologists，美国妇产科医师学会）出台的《染色体微阵列分析在产前诊断中的应用推荐》中指出，单纯依靠CGH技术不能识别平衡易位。
—— 技术介绍 ——
寻找平衡易位断点一直是行业内技术研发人员研究的热点之一。早期寻找平衡易位染色体断点的方法是通过原位杂交确定断点位置所在的区域，再通过染色体步移测序寻找断点，该方法费时费力，且成功率不高。2008年德国Ropers 研究小组采用特殊的流式细胞分选术分选平衡易位携带染色体，再对分选后的染色体进行高通量测序分析，从而找到断点，但由于这一技术需要特殊的流式细胞仪和分选技术，且测序成本也较高，难以进行有效地推广和临床应用。2011年美国约翰霍普金斯大学和哈佛大学的两个独立小组均报道了运用区域捕获技术结合高通量测序技术进行断点查找的工作，这一方法虽然可以大大减少测序通量，但是需要设计特殊的捕获芯片，费时费力，因而依旧难以应用于临床。2012年新英格兰医学杂志报道了美国哈佛大学的研究成果，即利用DNA环化建库结合高通量测序技术进行断点寻找。该方法无需进行中期分裂相的制备，可以利用DNA直接进行环化建库，分析断点信息，将断点分析又向临床推进了一步，然而，该方法需要用到特殊的建库方法，测序要求的数据量较大(约需测序两亿八千万reads)，在临床应用上仍有一定困难。
结合现有的相关文献及报道，国内外对于易位携带型胚胎的检测主要有以下几种方法：环化建库双端测序法、显微切割法、核型定位法以及单精子检测/废胚暴露断点法等。
1.环化建库双端测序法
技术原理
双端测序通过文库中插入DNA片段成环，可获取插入片段末端的信息，进行测序。通过双端测序找到父母染色体平衡易位携带者断裂点位置信息，根据断裂点上下游序列设计特异引物，用引物对胚胎单细胞全基因组扩增产物进行PCR验证，判断胚胎是否存在断裂点。其实现基础仍然是基于第二代测序技术的个体化设计，为易位型胚胎的鉴别提供新的方法。
临床应用
中国人民解放军总医院在2015年到2016年期间对该技术的临床应用可行性进行过验证。该验证实验共纳入了二对携带平衡易位的夫妇，最终有两对夫妇通过该技术筛选出了完全正常的胚胎，且得到了后期核型分析的确认，最终生育了完全正常的后代。
技术特点
通过双端测序精确定位染色体平衡易位的断裂点，针对每个患者设计引物，结合高通量测序技术，在对胚胎进行整倍体性筛查后，进一步鉴别出正常胚胎及易位型胚胎。
技术局限性
测序要求的数据量较大，且对于序列高度重复区域无法检测；另外在受精卵形成过程中胚胎的断裂点位置可能发生微小改变，这也可能会导致断点无法识别的情况发生。
2.显微切割法
技术原理
利用染色体显微切割技术获得易位染色体断点附近染色质，再利用高通量测序技术进行断点的精确定位，高通量测序技术测序信息有利于对平衡易位染色体进行后续分析，如可以利用这些信息设计引物，对平衡易位携带者的胚胎进行PGD诊断，分辨完全正常胚胎和易位型胚胎，通过仅移植完全正常的胚胎阻断平衡易位染色体在该家族中的传递。
整个实验分为预实验和正式实验两部分，预实验部分通过对染色体平衡易位携带者的核型分析，显微切割，高通量测序及一代测序获得精确断点位置，同时确定断点上下游SNP位点以用于连锁分析。正式实验部分对胚胎进行PGS检测，首先排除能确定为非平衡易位的异常胚胎，再通过PCR方法，检测剩余胚胎样本中是否存在断点（结合使用SNP连锁分析），最终筛选出完全正常的胚胎。
临床应用
中信湘雅生殖与遗传专科医院作为该项技术的研发单位，早期在8例平衡易位携带者家庭中成功运用了该技术。第一例平衡易位携带者经显微切割技术诊断完全正常的宝宝于2016年5月诞生，截止到2017年4月，该院已经帮助4例染色体易位患者生育了健康宝宝。
技术特点
1)通过显微切割技术，可以通过比对，从两个方向逼近断点，准确度高且测序成本较低；
2)通过预实验能获得精确的断裂点位置；
3)正式实验部分周期较短（2-3周）；
4)通过断点处PCR和 SNP连锁分析双重保险鉴别正常胚胎。
技术局限性
由于显微切割是人工操作，该方法对操作人员的技术有一定要求。
3.核型定位法
技术原理
核型定位是一种基于SNP芯片的PGD技术，其原理是对比胚胎与父母和近亲的DNA样本，对平衡易位受试者进行全基因组SNP基因分型，然后利用连锁分析构建携带者家系的全基因组单体型，分析非平衡易位胚胎单倍型确定断裂点，通过定位胚胎是否携带易位染色体单体型以及易位断裂点区域是否发生同源重组，来判断胚胎的染色体状态，实现正常型胚胎和易位型胚胎的精准区分
临床应用
上海复旦大学附属妇产科医院上海集爱遗传与不育诊疗中心对该技术进行了多个家系的临床验证，截至2017年3月，20个易位携带家庭中已有11个家庭成功生育了健康宝宝， 这些成功妊娠的孕妇均在孕中期接受了羊水穿刺，核型结果与PGH预测结果完全一致。
技术特点
1)有配套的分析软件，对数据分析要求简单；
2)SNP位点覆盖全基因组23对染色体；
3)通过一次大规模样本SNP芯片检测即可获得所需信息，无需再额外单独设计进行SNP连锁分析；
4)可以分析罗氏易位和平衡易位；
5)检测相对简单，适用于常规临床实验室。
技术局限性
由于是固定的SNP探针，某些平衡易位断点周围可能无可用的SNP信息。
4.单精子测序/废胚暴露断点法
技术原理
如果在活检时同时出现正常胚胎、易位型胚胎和染色体不平衡的胚胎，则首先针对这些异常胚胎做高通量测序，对这些胚胎中的异常拷贝数变异做进一步生物信息学分析确定断点，构建断点位置上下1Mb区域内的SNP单倍型，最终区分易位型和正常胚胎[9]；另外一项方案中，针对男方的平衡易位，采取的检测方案在技术上主要是依赖单精子检测技术，即利用易位重复型精子与易位缺失型精子的SNP信息进行比较，从而得出正常精子的单倍型，利用该信息，再结合女方相应位置上下纯合SNP信息，最终区分携带者和正常胚胎。
临床应用
郑州大学第一附属医院生殖医学中心应用该技术，已经完成47对染色体易位夫妇的PGD阻断， 12例成功妊娠的胎儿，经孕中期产前诊断，结果显示为染色体完全正常，目前已出生健康婴儿11例。
技术特点
1)准确性高：该技术中单细胞全基因组扩增技术扩增均一性好，等位基因脱扣率低，诊断准确性高；
2)易于操作：通过对染色体异常的精子或废弃胚胎即可寻找染色体的断裂位点，更易于操作；
3)应用范围广：对于所有的平衡易位类型及罗氏易位，都能通过该技术区分正常胚胎和易位型胚胎，应用范围更广。
技术局限性
对于胚胎种类有一定要求，在活检时必须有染色体不平衡的胚胎存在以暴露断点作为参考，才可以实现检测。
5.Basemapping方案
方案内容
BaseMapping方案是易位型胚胎检测的整体解决方案，包括显微切割技术、核型定位技术、DNA环化建库结合高通量测序技术。
技术原理
该技术里涉及的DNA环化建库测序技术主要是通过采集平衡易位携带者的细胞样本，对样本进行DNA片段化后环化，利用特有的技术获得环化接点位置的DNA序列，通过高通量测序和数据分析明确平衡易位的断点，并用长序列 PCR技术验证断点信息；此外，实验人员还会根据断裂点上下游信息寻找合适的SNP位点信息，最终利用断点信息结合SNP单倍体分析来区分正常胚胎和平衡易位携带胚胎，阻断平衡易位的传递。图片
临床应用
有一对患者夫妇，男34岁，女33岁。女方为平衡易位携带者，核型46,XY,t(5;22)(q33;q12)。在预实验阶段，研究人员通过DNA环化建库结合高通量测序技术对女方细胞样本进行断点定位到核苷酸水平。随后，对所获得的7个胚胎进行PCR断点验证，并结合SNP连锁分析确认，最终获得1枚正常的胚胎进行植入。
技术优势
1)断点精定位：选择最合适的检测技术，完成精确的断点定位；
2)方案灵活选择： BaseMapping提供的不同技术解决方案能够满足患者和医疗机构的不同需求。
3)样本全面适用：该方案全面适用于平衡易位、罗氏易位以及倒位携带者的PGD检测。
什么是平衡易位？
平衡易位又称为相互易位，是指两条染色体发生断裂后相互交换，
形成两条新的衍生染色体，大部分平衡易位对基因表达和个体发育无严重影响，
但平衡易位携带者会形成染色体不平衡配子，引发流产或复发性流产。
人群携带率约为1/500。
检测意义
遗传咨询：有利于医生对平衡易位携带者提供遗传咨询和临床决策依据。
即使本次助孕胎儿为平衡易位携带者，患者下次助孕及后代寻求助孕时可以利用已知的断点及相关信息，
仅需极低的费用就可以区分染色体平衡易位核型与完全正常核型胚胎，防止生育后代畸形或促发自发性流产。
阻断遗传：平衡易位携带者患者有机会优先选择完全正常的胚胎，阻断该平衡易位染色体在家族中的遗传，有利于优生优育。
Micro-Seq™平衡易位携带者PGD检测采用高通量测序技术和染色体显微切割技术（Micro-Seq™技术），
通过精确定位断点及与其连锁SNP位点，再通过断点分析进行诊断，从而可以筛查完全正常和平衡易位携带者胚胎。
● 精确断点法
● 测序通量低至百兆
检测关键点：精确定位断点
精确定位平衡易位染色体断点信息，通过在胚胎中检测这些断点信息是否存在，区分平衡易位携带胚胎与完全正常胚胎。
产品特点
● 精准：能精确定位断点及与其连锁SNP位点，断点精确至碱基水平
● 经济：高通量测序技术，测序量小，检测简便，性价比高
适用人群
常规染色体核型分析为染色体平衡易位携带者的患者
